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La Criobiologia studia gli effetti delle temperature criogeniche sulla materia vivente ed ha lo scopo di crioconservare nel tempo l’integrità strutturale e fisiologica di cellule e tessuti. Le temperature criogeniche vengono realizzate mediante l’utilizzo di azoto liquido, gas inerte, liquefatto, alla temperatura di -196,5°C. L’obiettivo della criobiologia è di preservare cellule e tessuti che potranno successivamente essere utilizzati per applicazioni cliniche e di ricerca.

La Crioconservazione del Tessuto Ovarico e dei gameti (ovociti e spermatozoi) sono strategie biomediche fondamentali per la preservazione della fertilità.

La preservazione della fertilità è un tema clinico che negli ultimi decenni sta emergendo notevolmente, in quanto è sempre più elevato il numero di pazienti in età fertile che rischiano di divenire sterili per molteplici motivi. Una delle patologie più rilevanti in questo contesto è il cancro.

Grazie alla diagnosi precoce di alcuni tumori e al netto miglioramento delle terapie antitumorali, il tasso di sopravvivenza delle pazienti oncologiche è fortemente aumentato. Ciò comporta che donne in età fertile che hanno avuto un cancro possono sperare, nel loro futuro, di concepire e diventare madri. Questo ha posto l’attenzione sulle conseguenze a lungo termine dei trattamenti antitumorali ai quali vengono sottoposte, ed ha sollevato il problema del mantenimento della funzionalità gonadica dopo la guarigione.

L’effetto gonadotossico dei trattamenti antitumorali (chemio e radioterapia) sul potenziale riproduttivo son noti da molto tempo [1], e possono comportare una soppressione parziale o totale della fertilità. L’entità del danno gonadotossico dipende da vari fattori, come: età della paziente, tipo, grado e stadio del tumore, dosaggio e durata della somministrazione dell’agente chemio e/o radioterapico.

Nelle donne in età fertile i trattamenti antitumorali possono compromettere o interrompere la funzionalità ovarica attraverso una massiccia riduzione del numero dei follicoli, inducendo così infertilità e menopausa precoce. Invece, nelle bambine prepuberi la chemio e /o radioterapia possono comportare una successiva assenza del menarca. Per migliorare la vita di queste pazienti è necessario l’utilizzo di tecniche di crioconservazione per preservare la loro fertilità.

Tra queste tecniche le più standardizzate sono la crioconservazione di ovociti, embrioni e blastocisti, che vengono eseguite nella maggior parte dei laboratori di procreazione medicalmente assistita ormai da quarant’anni. L’applicazione di queste tecniche ha una durata complessiva di circa 2-3 settimane e richiede una fase iniziale di stimolazione ovarica attraverso la somministrazione di gonadotropine, farmaci che inducono la crescita multipla dei follicoli. La crioconservazione di ovociti, embrioni o blastocisti ha un’elevata efficienza sia dal punto di vista biologico che clinico e non sono più considerate tecniche sperimentali [2].

Tuttavia esistono dei limiti nell’applicazione di queste tecniche nelle pazienti oncologiche prepuberi e anche nelle pazienti oncologiche in età fertile che non possono sottoporsi ad una stimolazione ovarica per la necessità di iniziare immediatamente il trattamento radio/chemioterapico, oppure per la presenza di un tumore ormone-sensibile (es. carcinoma mammario), in quanto la stimolazione ovarica con estrogeni potrebbe causare un peggioramento del tumore primario.

In queste tipologie di pazienti una valida alternativa per la preservazione della fertilità è la Crioconservazione del Tessuto Ovarico e il suo successivo trapianto. Ad oggi risulta essere ancora una tecnica sperimentale, ma ha il vantaggio di non richiedere una stimolazione ovarica ed ha la potenzialità di preservare sia la funzione riproduttiva che quella ormonale. Inoltre, poiché può essere effettuata in qualsiasi momento del ciclo mestruale consente di evitare il ritardo nell’inizio del trattamento chemio/radioterapico.

Per l’asportazione tessuto ovarico la paziente deve sottoporsi ad un intervento laparoscopico durante il quale vengono prelevati pezzi di corticale dell’ovaio che contengono un gran numero di follicoli primordiali e quindi un gran numero di ovociti. A seguito dell’intervento per via laparoscopica, la biopsia ovarica viene trasportata nel laboratorio di criobiologia all’interno di un contenitore sterile contenete una soluzione tamponata. In questa fase è di fondamentale importanza la sincronizzazione tra la sala operatoria e il laboratorio di criobiologia, al fine di ridurre al minimo i tempi tra il prelievo del tessuto e la sua crioconservazione. Una volta giunta al laboratorio di criobiologia la biopsia ovarica viene tagliata in piccoli frammenti e congelata.

Il metodo maggiormente applicato per congelare il tessuto ovarico è lo slow freezing (congelamento lento) che, attraverso l’utilizzo adeguato di crioprotettori (sostanze usate per proteggere i tessuti biologici dai danni prodotti dal congelamento), presenta un grado di sopravvivenza follicolare del 70-80% [3]. Una volta congelato il tessuto ovarico viene conservato in contenitori pieni di azoto liquido fino allo scongelamento e al successivo reimpianto nella paziente dopo la completa remissione della patologia neoplastica.

La crioconservazione del tessuto ovarico presenta però alcune criticità, in quanto essendo un sistema cellulare eterogeneo per forma, dimensioni e fisiologia è estremamente sensibile ai processi di congelamento/scongelamento. Questo problema viene in parte risolto grazie all’applicazione dello slow freezing, protocollo di crioconservazione ottimale per preservare l’integrità strutturale e fisiologica di tutte le componenti cellulari del tessuto ovarico.

Un’ulteriore problema è costituito dal possibile danno ischemico a cui va incontro il tessuto ovarico dopo il reimpianto. A causa dei fenomeni di ischemia il tessuto ovarico è soggetto ad infiammazione e stress ossidativo, per questo è importante l’utilizzo degli antiossidanti durante il congelamento/scongelamento. Inoltre il tempo di riperfusione (ritorno del flusso ematico) risulta critico per la sopravvivenza dei follicoli, per cui è fondamentale accelerare la neoangiogenesi (formazione di nuovi vasi sanguigni) oltre a garantire una corretta conservazione dei vasi nel tessuto scongelato [4,5].

Dopo la completa remissione della patologia neoplastica il tessuto ovarico viene scongelato e può essere reimpiantato in un sito ortotopico o in un sito eterotopico.

Nel trapianto ortotopico il tessuto viene reinserito nella sua sede originaria, ossia all’intero della cavità pelvica sull’ovaio rimanente o nell’ambiente uterino. Il trapianto ortotopico può teoricamente permettere concepimenti spontanei se il resto dell’apparato riproduttivo non ha subito danni, in quanto ripristina sia la funzione ormonale che riproduttiva.

Nel trapianto eterotopico il tessuto è posizionato in una sede differente da quella originaria, solitamente facilmente raggiungibile per il recupero di ovociti, come per esempio l’avambraccio o in una tasca sottocutanea addominale [6]. Queste sono sedi riccamente vascolarizzate che favoriscono l’impianto del tessuto ovarico, ma presentano un microambiente differente e non fisiologico per lo sviluppo follicolare che può provocare ripercussioni negative sulla qualità degli ovociti. Il trapianto eterotopico ripristina la funzione ormonale ma ovviamente non permette concepimenti spontanei e dopo aver recuperato gli ovociti si possono applicare soltanto tecniche di procreazione medicalmente assistita. La stragrande maggioranza dei lavori presenti in letteratura afferma che è quasi impossibile l’ottenimento di una gravidanza dopo trapianto eterotopico.

Nonostante esso permetta la ripresa della funzionalità ovarica, influisce negativamente sulla qualità degli ovociti e quindi sulla loro capacità di formare embrioni vitali, per cui il trapianto eterotopico è sconsigliato nel caso in cui la paziente sia alla ricerca di una gravidanza.

Dopo il reimpianto del tessuto ovarico (sia ortotopico che eterotopico) la ripresa della funzionalità endocrina ovarica si ottiene nel 90-100% dei casi ed avviene dopo 3-6 mesi e può persistere fino a 4-5 anni [7].

Ad oggi sono nati più di 100 bambini dall’autotrapianto ortotopico di tessuto ovarico e circa il 50% sono stati concepiti spontaneamente, mentre l’altra metà con tecniche di fecondazione assistita. La maggior parte delle gravidanze spontanee insorge nei primi anni dopo il trapianto ma sono state riportate gravidanze spontanee anche dopo 5-6 anni.

Il principale problema di sicurezza nell’autotrapianto di tessuto ovarico nelle pazienti oncologiche è rappresentato dalla potenziale reintroduzione di cellule cancerose. Per questo è di fondamentale importanza una maggiore applicazione di test istologici e molecolari per valutare la presenza di cellule trasformate nel tessuto da reimpiantare. Sono state riportate due recidive di malattia, una in una paziente con tumore dalla cervice e un’altra in una paziente con tumore della mammella che si erano sottoposte a autotrapianto di tessuto ovarico. Sebbene queste recidive potrebbero non essere dovute al trapianto, è indispensabile prevedere un adeguato screening preoperatorio per escludere un possibile coinvolgimento ovarico e un’attenta analisi istologica sui frammenti di tessuto prima del reimpianto.

Nel 2018, è stata effettuata una revisione dei risultati della crioconservazione e del trapianto di tessuto ovarico su tutti i dati presenti nella letteratura. Complessivamente sono state analizzate 360 procedure di trapianto nelle quali è stato riscontrato il 95% di ripristino della funzionalità ovarica e in totale sono state ottenute 131 gravidanze con 91 nati. In 9 donne è stata diagnosticata una recidiva dopo il trapianto, ma in nessun caso il tumore è stato messo in diretta relazione con il trapianto. [8]

Sebbene questa tecnica di preservazione della fertilità sia in rapida diffusione è ancora considerata sperimentale e dovrebbe essere attuata solo in centri con adeguate competenze di crioconservazione, ma soprattutto in centri in grado di offrire le più sensibili e aggiornate tecniche di analisi istologica e molecolare del tessuto prima del trapianto.